Cultivo de bacterias marinas del clado SAR202.

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 5098 (2023) Citar este artículo

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Las bacterias del clado SAR202, dentro del filo Chloroflexota, están distribuidas de forma ubicua en el océano, pero aún no se han cultivado en el laboratorio. Se ha propuesto que las antiguas expansiones de parálogos de enzimas catabólicas ampliaron el espectro de compuestos orgánicos que las bacterias SAR202 podían oxidar, lo que llevó a transformaciones del ciclo del carbono de la Tierra. Aquí, informamos el cultivo exitoso de bacterias SAR202 a partir de agua de mar superficial mediante cultivo de dilución hasta extinción. El crecimiento de estas cepas es muy lento (0,18-0,24 día-1) y se inhibe con la exposición a la luz. Los genomas, de ca. 3,08 Mbp, codifican archaella (estructuras de motilidad de arqueas) y múltiples conjuntos de parálogos enzimáticos, incluidos 80 genes que codifican enzimas de la superfamilia enolasa y 44 genes que codifican deshidrogenasas dependientes de NAD (P). Proponemos que estos parálogos de enzimas participen en múltiples vías paralelas para el catabolismo no fosforilativo de azúcares y ácidos de azúcares. De hecho, demostramos que las cepas SAR202 pueden utilizar varios sustratos que se metabolizan a través de las vías previstas, como los azúcares ʟ-fucosa y ʟ-ramnosa, así como sus formas lactona y ácida.

El clado SAR202 del filo Chloroflexota se distribuye ubicuamente en el océano y representa entre el 10% y el 30% de los procariotas planctónicos en las profundidades marinas1,2,3,4,5,6,7. Se han interpretado varias propiedades asociadas con la organoheterotrofia y el metabolismo del azufre y el nitrógeno a partir de ensamblajes de metagenoma de SAR202 y secuencias de genoma unicelular6,8,9,10,11,12. Los siete grupos (subclados) de SAR202 se distinguen individualmente en el número y tipo de parálogos que contienen8,12, lo que sugiere una relación entre la evolución de los parálogos y la especialización de nicho de los subclados.

Se propone que los genes parálogos de monooxigenasa dependiente de flavina del grupo III SAR202, que en algunos casos superan los 100 por genoma, evolucionaron para recolectar carbono y energía de diversas moléculas orgánicas que se acumularon en los océanos durante la expansión del ciclo del carbono de la Tierra, tras el aumento de fototrofia oxigenada8,12,13. De manera similar, en el grupo I SAR202, se propone que grandes expansiones de parálogos en la superfamilia de proteínas enolasa evolucionaron para permitir que estas células metabolicen compuestos que resisten la oxidación biológica debido a su complejidad quiral. La ramificación temprana de estos parálogos en árboles filogenéticos indica que la evolución de las células SAR202 fue un crisol para su diversificación8,12,13.

Las células SAR202 se encuentran en todas las columnas de agua del océano y alcanzan su mayor número cerca de la superficie del océano, pero contribuyen con un mayor porcentaje de todas las células de plancton en las zonas meso, batí, hadal y abisopelágica5,10,12. Los SAR202 de los grupos I y II tienen genes de rodopsina en sus genomas y son los SAR202 más abundantes en ambientes epipelágicos, mientras que el grupo III, que carece de genes de rodopsina, es en gran medida responsable de la alta abundancia relativa de SAR202 en el océano oscuro.

El cultivo de tipos de células no representadas es una prioridad para los microbiólogos porque las células frecuentemente exhiben propiedades que no pueden predecirse fácilmente a partir de sus genomas14. Un estudio reciente ha demostrado que la inferencia basada en el genoma no logra predecir de manera confiable las vías catabólicas para más del 50% de las fuentes de carbono utilizadas por diversos procariotas que tienen datos fenotípicos bien seleccionados15. A pesar del reciente aumento del interés y los avances tecnológicos en el cultivo, una alta proporción de grupos procarióticos siguen sin cultivar16. El clado SAR202 aún no tiene aislamientos cultivados, lo que lo convierte en uno de los “más buscados” en cultivo y un “objetivo de cultivo” clave14,17.

Aquí informamos el cultivo exitoso de la bacteria SAR202. Se recuperaron veinticuatro aislados del subclado I de muestras de agua de mar superficial mediante dilución hasta extinción en medios de agua de mar estériles. Reconstrucción metabólica respaldada por datos experimentales con células implicadas en parálogos de enolasa y deshidrogenasa en la oxidación de azúcares no fosforilativos. Proponemos que múltiples vías metabólicas paralelas de este tipo permitan a estas células recolectar mezclas complejas de compuestos relacionados con el azúcar a partir de reservas de carbono orgánico disuelto. SAR202, que se encuentra en toda la columna de agua de los océanos modernos, evolucionó simultáneamente con el aumento de la fototrofia oxigenada13. Proponemos que se expandieron al nicho de recolectar moléculas diluidas y diversas relacionadas con los carbohidratos a medida que los océanos se oxidan.

Los experimentos de dilución hasta extinción con medios heterótrofos bajos en nutrientes (LNHM; Tabla complementaria 1) en placas de microtitulación recuperaron veinticuatro aislados de SAR202 grupo I de muestras de superficie (profundidad, 10 m) de dos estaciones (GR1 y GR3) ubicadas cerca de Garorim. Bahía del Mar Amarillo (Figura complementaria 1a). Cuatro condiciones, que se diferencian por la adición de catalasa y la exposición a la luz (oscuridad continua versus ciclo de luz-oscuridad de 14:10 h), produjeron 610 cepas, de las cuales 24 pertenecían al clado SAR202 (Tabla complementaria 2). Las 24 cepas de SAR202 se obtuvieron de cultivos incubados continuamente en la oscuridad (Tabla complementaria 2).

Las comparaciones filogenéticas mostraron que los aislados tenían secuencias del gen 16S rRNA casi idénticas, estaban afiliados al grupo I de SAR202 (Fig. 1a)3,8,12 y correspondían a la variante de secuencia de amplicón (ASV) principal (más del 68%) del Clado SAR202 (0,7–1,0% en procariotas totales) en las muestras de agua (Figura complementaria 2).

un árbol filogenético basado en secuencias del gen 16S rRNA que muestra la relación entre las 24 cepas de SAR202 aisladas en este estudio y secuencias estrechamente relacionadas recuperadas de varias bases de datos, incluidas GTDB (marcada en morado), IMG (amarillo), GenBank y EzBioCloud. Las cuatro cepas SAR202 seleccionadas para la secuenciación del genoma están marcadas en rojo. Se utilizó RAxML (v8.2.12) para la construcción de árboles con el modelo GTRGAMMA. Se indican los valores de soporte de Bootstrap (≥70%; de 100 remuestreos). Dehalococcoides mccarty se estableció como un grupo externo. Barra, 0,1 sustituciones por posición de nucleótido. b Árbol filogenómico del clado SAR202. Los cuatro genomas de las cepas SAR202 de este estudio (marcadas en rojo) y otros MAG y SAG de estudios anteriores se clasificaron utilizando GTDB-Tk. Para la construcción de árboles se incluyeron genomas representativos de grupos de especies de los taxones GTDB, en los que se clasificaron los genomas SAR202 analizados. La designación de los subgrupos de SAR202 siguiendo el esquema de clasificación de un estudio previo12 se indica en el lado izquierdo del árbol con sombreados de colores. En el lado derecho del árbol, se muestra la asignación taxonómica de los genomas a nivel de familia y orden según la GTDB (versión 202). La construcción del árbol se realizó utilizando RAxML (v8.2.12), con la opción PROTGAMMAAUTO, basada en una alineación concatenada de genes centrales obtenidos por la tubería UBCG. Los valores de soporte de Bootstrap (100 iteraciones) se indican en los nodos. Barra, 0,1 sustitución por posición de aminoácido.

Cuatro cepas seleccionadas para experimentos adicionales, JH545, JH702, JH639 y JH1073, se comportaron de manera similar, crecieron lentamente (0,18 a 0,24 días −1) y mostraron sensibilidad a la luz (Fig. 2a-c). La cepa JH545 creció de manera óptima a 15-20 °C (Figura complementaria 3) y, por lo tanto, todos los experimentos posteriores se realizaron a 20 °C. Se necesitaron aproximadamente 50 días para alcanzar la fase estacionaria con densidades celulares máximas de ~ 2 × 108 células ml-1 (Fig. 2a). Muy poco crecimiento seguido de una disminución gradual a 4 °C (Figura complementaria 3) sugiere que la cepa JH545 perteneciente al grupo I de SAR202 puede no estar bien adaptada a las profundidades marinas, donde otros miembros del clado SAR202 (p. ej., grupo III) son frecuentes12.

a Curvas de crecimiento inicial de cuatro cepas representativas de SAR202 en medio heterótrofo bajo en nutrientes (LNHM) en condiciones de oscuridad. b Curvas de crecimiento de las cuatro cepas en condiciones continuas de oscuridad y luz-oscuridad en LNHM. Se aplicó un ciclo de luz-oscuridad (14:10 h) utilizando lámparas LED con una intensidad de luz de ~155 μmol fotones m–2 s–1. Para la condición de oscuridad, los tubos se envolvieron en papel de aluminio. c Curvas de crecimiento de la cepa JH545 en condiciones de oscuridad y varias intensidades de luz en LNHM5x. Todos los cultivos se incubaron inicialmente en la oscuridad (es decir, los tubos se envolvieron en papel de aluminio). En el día indicado por una flecha negra, algunos cultivos se cambiaron a condiciones de luz (es decir, se retiró el papel de aluminio) y se expusieron a la luz con las siguientes intensidades: WL, ~45; LM, ~89; SL, ~134 μmol de fotones m–2 s–1. El experimento en c se realizó por triplicado. Los datos se presentan como valores medios ± SEM. Tenga en cuenta que las barras de error quedan ocultas cuando son más cortas que el tamaño de los símbolos. a–c Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. d – f Micrografías electrónicas de células de la cepa JH545 observadas por TEM (d), TEM de sección delgada (e) y SEM (f). Barras de escala, 100 nm.

El crecimiento de las cuatro cepas fue inhibido por ciclos de luz-oscuridad con luces LED de amplio espectro (Fig. 2b), y los experimentos con la cepa JH545 mostraron que la exposición continua a la luz provocó una inhibición del crecimiento seguida de la muerte celular en todas las intensidades de luz probadas (~45 –134 μmol fotones m −2 s −1), con variaciones en los niveles de respuesta (Fig. 2c).

Aunque los aislados eran cultivos puros, la microscopía TEM y SEM mostró bastones cortos (~0,8 × 0,4 μm), cocos (diámetro, ~0,5 μm), discos y discos con centros bicóncavos que a veces parecían toroidales, como se informó para las cepas. de Dehalococcoides18,19, un género que pertenece a la misma clase (Dehalococcoidia) que SAR202 (Fig. 2d-f y Fig. complementaria 4). Las imágenes TEM de sección delgada indicaron envolturas de células monodermis, similares a otras Chloroflexota (Fig. 2e)20,21.

Los genomas de las cuatro cepas SAR202 tenían entre 3083 y 3094 kb de longitud con un contenido de GC del 51,8%, una densidad de codificación de ~87,5% y al menos un 99,9% de identidad de nucleótidos promedio (ANI) entre las cepas. Los dos genomas secuenciados en la plataforma PacBio (JH545 y JH1073) se ensamblaron en un contig circularmente cerrado, mientras que los otros dos genomas secuenciados con tecnología Illumina estaban compuestos por más de 30 contigs (~846 kb de N50 para ambos genomas) (Figura complementaria. 5c). El mapa circular del genoma JH545 mostró varias regiones con contenido anómalo de GC y sesgo de GC (Figura complementaria 5a), muchas de las cuales se superpusieron con las islas genómicas predichas (Figura complementaria 5b).

Las características metabólicas inferidas por el genoma fueron casi idénticas entre los cuatro genomas (p. ej., perfiles COG; Tabla complementaria 3), lo que nos llevó a centrarnos en uno de ellos, JH545, para un análisis más detallado (Fig. 3). De acuerdo con estudios previos, la anotación del genoma indicó un metabolismo central de carbono y energía típico de los organoheterótrofos aeróbicos, con algunos genes que indican capacidades de litotrofia por oxidación de sulfuro (sulfuro:quinona oxidorreductasa) y respiración anaeróbica por reducción de nitrato (NapAB) y reducción de N2O (NosZ). ) (Notas complementarias). La presencia de NapAB y NosZ ha sido reportada en los MAG SAR202 obtenidos de la “zona muerta” del norte del Golfo de México, donde se detectó la expresión de estos genes en las muestras con menor oxígeno disuelto9. De acuerdo con análisis previos del genoma de miembros de Dehalococcoidia19,22,23, la biosíntesis de peptidoglicano no estaba codificada en los genomas de SAR202. Las imágenes TEM mostraron una capa fuera de la membrana celular de JH545 (Fig. 2d, e), que recuerda a la capa S observada en cepas de Dehalococcoidia que carecen de peptidoglicano24,25.

Algunas vías metabólicas clave están indicadas con cuadros azules. La información detallada sobre las enzimas correspondientes a los números junto a las flechas está disponible en los Datos complementarios 1. Los colores de los transportadores en la parte inferior indican categorías funcionales: rosa, transportadores ABC; azul, otros. Figura creada con BioRender.com.

Las filogenias del genoma completo de la Base de datos de taxonomía del genoma (GTDB) indican que las células SAR202 del grupo I que cultivamos representan aislados de un orden hasta ahora no cultivado (UBA1151) dentro de un superorden monofilético compuesto por todos los SAR202 (Fig. 1b y Notas complementarias). Proponemos el nombre taxonómico provisional “Candidatus Lucifugimonas marina”, que incluye las cepas JH639, JH702 y JH1073, además de la cepa JH545 como cepa tipo. Para dar cabida a este nuevo género y especie, también proponemos la familia “Candidatus Lucifugimonadaceae”. nov. y la nueva orden “Candidatus Lucifugimonadales” ord. nov. dentro de la clase Dehalococcoidia (consulte la sección Métodos).

En los cuatro genomas de SAR202 se predijo un grupo de genes para archaellum, una estructura de motilidad de las arqueas. Este grupo de genes es similar a las disposiciones conservadas de los genes de archaellum observados en archaea26, 27 e incluye seis copias en tándem de flaB (que codifica arquelina), seguidas de los genes flaGFHIJ (Figura complementaria 6). Seis copias adicionales de genes flaB estaban esparcidas por todo el genoma. También se predijo un gen candidato para FlaK, una familia de prepilina peptidasas que eliminan los péptidos señal de la arquelina26, basándose en la asignación a COG1989 y la presencia del dominio PF01478 (Peptidasa_A24; familia de peptidasas líder tipo IV)28.

Archaella está relacionada con los pili tipo IV y no tiene relación evolutiva con los flagelos bacterianos. Aunque anteriormente se informó que una Chloroflexota MAG del sedimento de un acuífero albergaba un grupo de genes para archaellum29, nunca se ha informado que aislados bacterianos alberguen archaella. Las búsquedas de homólogos de FlaB en la base de datos IMG revelaron que dos MAG SAR202 del Golfo de México tenían grupos de genes archaellum muy similares al de JH545 (Figura complementaria 6)9. La exploración de la distribución de FlaB (K07325) utilizando la base de datos AnnoTree mostró que la mayoría (45 de 52) genomas bacterianos que albergaban flaB estaban afiliados a Chloroflexota. Los siete genomas bacterianos restantes que tenían flaB se distribuyeron entre siete filos, lo que indica que este gen es muy raro entre otras bacterias. De los 45 genomas de Chloroflexota que albergan flaB, 40 estaban entre los 212 genomas de Dehalococcoidia en la base de datos, y los 5 restantes estaban en Anaerolineae. Esta distribución sugiere que los genes de Archaella podrían haber sido transferidos de Archaea a un ancestro de Chloroflexota y retenidos en la clase Dehalococcoidia. Un análisis filogenético de secuencias FlaB encontradas en la cepa JH545, varios genomas de Chloroflexota y aislados de arqueas representativos confirmó esta inferencia. Las secuencias FlaB de Chloroflexota formaron un clado monofilético, que se ubicó como un clado hermano de un grupo FlaB arqueal (Figura complementaria 7). La investigación de los 45 genomas de Chloroflexota que tienen FlaB (que se encuentra en AnnoTree) y las búsquedas BlastP en el NCBI (FlaB de la cepa JH545 como consulta) reveló que se han cultivado al menos dos cepas de Chloroflexota que albergan un grupo de genes archaella (flaB y varios otros genes): Litorilinea aerophila30,31 y Aggregatilinea lenta32 (Figura complementaria 6). No se observaron arquelas durante el examen microscópico de las células SAR202.

Se detectaron dos copias de los genes de heliorrodopsina (HeR) en el genoma JH545. En un estudio reciente de SAR202 MAG/SAG marinos, se encontraron genes de rodopsina en 28 genomas de los grupos I y II, todos recuperados de profundidades de agua de menos de 150 m. Se informó un gen HeR en un solo genoma del grupo II12. Por lo tanto, este hallazgo representa la presencia de HeR en el grupo I de SAR202. Las dos copias de HeR encontradas en el genoma JH545 exhibieron ~83% de identidad de aminoácidos y se ubicaron en un gen aguas abajo de la ADN fotoliasa, que repara el daño del ADN causado por la exposición a los rayos UV usando luz visible. luz (Figura complementaria 8a). El alineamiento de secuencias múltiples mostró que las dos copias diferían en el residuo de aminoácido que causó un cambio espectral en un estudio de mutagénesis por escaneo de Ala (W163 en 48C12; Figura complementaria 8b), lo que sugiere que las dos copias de HeR podrían tener espectros de absorción diferentes. Aunque la función del HeR sigue sin resolverse, recientemente se ha sugerido que podría funcionar como un sensor de luz que regula las respuestas al estrés oxidativo inducido por la luz34,35. Dado que no se ha encontrado HeR en el grupo III de SAR202, que abunda en el océano oscuro12, la posesión de HeR por parte de JH545 aislado de las aguas superficiales costeras puede indicar una adaptación al hábitat eufótico.

De acuerdo con un estudio previo9, se encontró una gran cantidad de transportadores de la superfamilia de facilitadores principales (MFS) en el genoma JH545, incluidas 42 proteínas asignadas a COG0477 (Tabla complementaria 3). MFS es una familia muy grande de transportadores de membrana que se sabe que transportan una variedad de compuestos, incluidos mono y oligosacáridos, aminoácidos y nucleósidos36,37. Es de destacar que se sabe que algunos sustratos que informamos a continuación mejoran el crecimiento de JH545 (consulte la siguiente sección sobre COG4948) son transportados por proteínas MFS38,39,40.

Se asignaron dieciocho proteínas en el genoma JH545 a COG3119, anotadas como arilsulfatasa A o una enzima relacionada (Tabla complementaria 3). Los parálogos de sulfatasa se han informado anteriormente en los grupos I y II de SAR20212. Las arilsulfatasas catalizan la desulfatación de carbohidratos sulfatados en algunas vías catabólicas, por ejemplo, la vía de degradación del ulvan por una bacteria marina41.

Los genomas del SAR202 cultivado que informamos codifican 80 proteínas COG4948 en la familia mandelato racemasa dentro de la superfamilia de enolasas (~ 2,8% de CDS; Tabla complementaria 3). Muchas bacterias marinas tienen genomas mínimos con pocos parálogos, por lo que los conjuntos inusualmente grandes de parálogos presentes en diversos grupos de SAR202, como COG4948 y COG2141 en los grupos I y III, respectivamente, atrajeron la atención cuando se descubrieron por primera vez12.

Intentamos establecer si la expansión de COG4948 en el grupo I de SAR202 es inusual en el contexto de la diversidad procariótica. Analizamos los genomas en GTDB, una de las bases de datos de genomas filogenéticamente más completas. Debido a que la anotación COG no es escalable, contamos los números de los dos dominios Pfam (PF02746 y PF13378) correspondientes a COG4948 (consulte Materiales y métodos para obtener más detalles) y calculamos la proporción de proteínas COG4948 entre todos los CDS en cada genoma. Entre los 47,894 genomas representativos del grupo de especies de GTDB (R202), los 48 genomas del grupo I de SAR202 (o__UBA1151 en GTDB) se ubicaron entre los 66 primeros, excepto uno que ocupó el puesto 134, en proporciones de COG4948 (Fig. 4a), lo que demuestra que el La expansión paralela de COG4948 es una característica destacada del grupo I de SAR202 en todos los procariotas.

a Proporción de proteínas COG4948 entre los genomas representativos del grupo de especies de GTDB (versión 202; 47,894 genomas). Sólo se incluyen los 200 genomas principales con la mayor proporción. Los genomas de o_UBA1151 (SAR202 grupo I) se indican con un color distinto. Los 48 genomas de o__UBA1151 están incluidos en esta figura debido a la alta proporción de COG4948. La flecha negra en el eje y indica la proporción de los cuatro genomas de SAR202 secuenciados en este estudio (~2,8%). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. b Análisis SSN (red de similitud de secuencia) de diversas proteínas COG4948 predichas en el genoma JH545. Las proteínas UniProt con los dos dominios Pfam, PF02746 y PF13378, se incluyeron en el análisis junto con las 80 proteínas COG4948 de la cepa JH545. En esta figura solo se retuvieron los grupos de proteínas, incluidas las proteínas JH454, después de aplicar un valor de corte umbral a la puntuación de alineación (≥150). Los nodos (proteínas) están coloreados según su taxonomía a nivel de filo, siguiendo los códigos de color en la parte inferior. Las 80 proteínas COG4948 del genoma JH545 están indicadas en triángulos rojos. Las cuatro proteínas que se han estudiado experimentalmente están indicadas con rectángulos negros (UniProt ID: D8ADB5, C9A1P5, C6CBG9 y A8RQK7).

Analizamos la divergencia de secuencia entre las 80 proteínas COG4948 del genoma JH545 mediante la construcción de una red de similitud de secuencia (SSN) utilizando la herramienta de similitud de enzimas (EFI-EST) de Enzyme Function Initiative42. La mayoría de los ~70 grupos que contenían proteínas JH545 como miembros incluían solo un gen JH545, lo que indica que las proteínas JH545 COG4948 son muy divergentes (Fig. 4b). Si bien muchos de los grupos COG4948 más grandes incluían diversos filos bacterianos, muchos grupos pequeños estaban compuestos principalmente por Chloroflexota, lo que sugiere que la familia de proteínas COG4948, que se distribuye ampliamente entre los procariotas, se diversificó en Chloroflexota. Solo el grupo más grande, que incluía dos proteínas JH545, contenía proteínas estudiadas bioquímicamente43 (Fig. 4b).

Proponemos que siete conjuntos de parálogos (COG1028, COG0667, COG3618, COG4948, COG1063, COG3836 y COG0329), incluidos los parálogos COG4948 más abundantes, actúen de manera concertada en vías paralelas que recolectan energía de diversos carbohidratos (Fig. 5b), y proporcionan evidencia experimental de que las células cultivadas del grupo I SAR202 responden a los sustratos predichos de estas vías (Fig. 5a). Los conjuntos de COG más grandes en los genomas de SAR202 de este estudio, además de las racemasas mandeladas (COG4948), incluyeron deshidrogenasas dependientes de NAD (P) (COG1028), aldolasas (COG3836) y oxidorreductasas (COG0667; Tabla complementaria 3). Estas enzimas se encuentran en vías no fosforilativas de diversos azúcares y su catabolismo ácido (p. ej., fucosa, ramnosa, arabinosa y xilosa)39, 44,45,46,47,48,49. Para estas vías son fundamentales las enzimas de emparejamiento de los dos conjuntos de parálogos más grandes, las enzimas mandelato racemasas y las deshidrogenasas dependientes de NAD(P), que catalizan una reacción de deshidratación seguida de una reacción de oxidación que da como resultado un flujo de electrones para la respiración. Un análisis previo del pangenoma SAR202 de la variación en el número de copias de COG encontró correlaciones positivas significativas en el número de copias de los mismos siete COG (Tabla complementaria 3) en los genomas del grupo I de SAR202 en relación con otros genomas de SAR20212. Las distribuciones filogenéticamente correlacionadas de estas expansiones parálogas respaldan nuestra predicción de que desempeñan funciones metabólicas coordinadas.

a Crecimiento de la cepa JH545 en varios compuestos de carbono que se predijo que requerirían enzimas COG4948 para su metabolización. Se agregaron compuestos de carbono al medio ASW5x (Tabla complementaria 1) a una concentración final de 250 μM. Solo mezcla de carbono, no se agregaron compuestos de carbono adicionales, excepto la mezcla de carbono ya incluida en el medio ASW5x. La incubación se realizó en oscuridad a 20 °C. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Los datos se presentan como valores medios ± SEM. Tenga en cuenta que las barras de error quedan ocultas cuando son más cortas que el tamaño de los símbolos. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. b Supuestas vías catabólicas no fosforilativas de l-fucosa y l-ramnosa inferidas de los datos del genoma SAR202. El número de proteínas asignadas a los COG se indica entre paréntesis junto a los ID de los COG en cada paso.

Reconstruimos vías no fosforilativas para la oxidación de dos azúcares relevantes para ambientes marinos, fucosa y ramnosa50, 51, en los genomas de las cepas SAR202 cultivadas en base a varios estudios previos46,47,52,53,54,55 (Fig. 5b ). Aunque se sabe que tanto la ramnosa como la fucosa se degradan mediante vías que implican la fosforilación en muchos organismos, estas vías dependientes de quinasa no se encontraron en los genomas. Esto sugiere que las vías no fosforilativas reconstruidas que se muestran en la figura 5b podrían servir como las únicas rutas catabólicas para ambos azúcares en estas cepas. En la reconstrucción de la vía, la l-fucosa y la l-ramnosa comparten la misma anotación COG en cada paso, produciendo piruvato y lactato o lactaldehído como productos finales. Siete de los ocho COG representados en las vías reconstruidas para el catabolismo de fucosa y ramnosa provenían de los abundantes conjuntos de parálogos descritos anteriormente, que van de 9 a 80 variantes de cada COG (Tabla complementaria 3).

Probamos la respuesta de crecimiento de las células JH545 a metabolitos externos que se predijo que serían sustratos para las vías catabólicas propuestas anteriormente. En estos experimentos utilizamos un medio definido a base de agua de mar artificial, al que añadimos los mismos cofactores y compuestos orgánicos que se utilizaron para el aislamiento original de las cepas. No examinamos si los sustratos probados podrían servir como únicas fuentes de carbono debido a la muy baja tasa de crecimiento de las células y porque las células adaptadas a ecosistemas oligotróficos a menudo exhiben una flexibilidad metabólica reducida en comparación con las células copiotróficas cuando se enfrentan a mezclas de carbono simplificadas. Todos los sustratos probados, incluidos ʟ-fucosa, ʟ-ramnosa, sus formas lactona y ácida, y el ascorbato mejoraron el crecimiento de la cepa JH545 en medios artificiales de agua de mar (Fig. 5a). Con aumentos en las tasas de crecimiento, las densidades celulares en la fase exponencial tardía (~35 días de incubación) fueron más de 10 veces mayores en los cultivos modificados con sustrato, aunque los cultivos alcanzaron densidades similares en la fase estacionaria. Se probó el ascorbato porque una vía de degradación del ascorbato que requería una enzima COG494839,48 estaba casi completa en el genoma JH545 (Figura complementaria 9).

La distribución vertical de la población a nivel de especie representada por JH545 (en adelante, población JH545) en metagenomas marinos siguió patrones observados previamente para varios miembros del grupo I de SAR20212. En los metagenomas de Tara Oceans y la estación ALOHA, la abundancia relativa de la población JH545 fue mayor en la zona mesopelágica (200–1000 m) en comparación con la zona eufótica (superficie hasta 200 m) (prueba U de Mann-Whitney, P = 1,78 × 10-10, unilateral (Fig. 6c). En los metagenomas de varias fosas marinas, la abundancia relativa de la población JH545 generalmente aumentó al aumentar la profundidad por encima de la zona hadopelágica (por debajo de 6000 m), donde su abundancia relativa disminuyó (Fig. 6a, b). Dada la disminución general del número de células con el aumento de la profundidad del agua56,57,58, es probable que la población JH545 se encuentre en toda la columna de agua del océano, alcanzando su concentración más alta en la zona epipelágica pero aumentando en abundancia relativa en el océano oscuro. Esta inferencia también es consistente con estudios recientes que informan una mayor abundancia de células SAR202 en la zona eufótica en comparación con la zona afótica en el Océano Atlántico y el Estrecho de Fram, medida mediante el recuento de células basado en FISH12,59. Las probables altas abundancias absolutas de la población JH545 observadas en las zonas eufóticas aparentemente entran en conflicto con las observaciones de inhibición del crecimiento por ciclos de luz-oscuridad y muerte en luz continua de las cepas cultivadas tras la exposición a luz blanca de amplio espectro (Fig. 2b, c). . Para conciliar estas observaciones, planteamos la hipótesis de que JH545 utiliza sus dos copias de heliorrodopsina para regular funciones que se ven afectadas negativamente por la luz, mitigando su susceptibilidad a la inhibición34, y observamos que el espectro de acción para la inhibición de la luz no se ha determinado y las células podrían ser sensible a las frecuencias que normalmente se absorben en la columna de agua. De todos modos, nuestros hallazgos indican que el desafío de cultivar estas células podría explicarse en parte por su sensibilidad a la luz.

a, c Se representan gráficamente las abundancias relativas para varias estaciones y profundidades de las cuatro fosas marinas con profundidades de agua de más de 6000 m (a) y las estaciones ALOHA y TARA Oceans (c). Para TARA Oceans, solo se utilizaron estaciones con muestras de profundidades de agua de menos de 100 my más de 250 m. La línea horizontal de puntos en (c) indica una profundidad de 200 m, el límite entre las zonas epipelágicas (eufóticas) y mesopelágicas. Los colores de las burbujas en (c) corresponden a los océanos donde se ubican las estaciones de muestreo, siguiendo la leyenda de la derecha: SO, el Océano Austral; IO, el Océano Índico; SAO y NAO, el Océano Atlántico Sur y Norte, respectivamente; SPO y NPO, el Océano Pacífico Sur y Norte, respectivamente. b Los datos utilizados en (a) se volvieron a trazar para mostrar el cambio en las abundancias relativas en función de la profundidad. La línea de regresión (en azul) y los intervalos de confianza (95%; sombreado gris) se dibujaron mediante la función "geom_smooth" del paquete ggplot2 R con el método "gam" (modelo aditivo generalizado). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Proponemos que la distribución vertical de los miembros del grupo I de SAR202 representados por la población JH545 pueda conciliarse con sus características metabólicas que informamos aquí. Los compuestos que mejoraron el crecimiento de JH545 (p. ej., fucosa y ramnosa) y compuestos relacionados que predecimos que las bacterias JH545 y SAR202 del grupo I también podrían utilizar se encuentran en la superficie del océano en gran medida como monómeros en polisacáridos producidos por el fitoplancton51. El genoma JH545 tenía un repertorio limitado de glucósidos hidrolasas (GH) y carecía de familias de GH representativas anotadas como fucosidasa y ramnosidasa (p. ej., GH29, GH95, GH141, GH78 y GH106)41, 50,60. El grupo I de SAR202 puede eliminar compuestos monoméricos y sus productos metabólicos que se difunden en la columna de agua durante la degradación de polisacáridos por otros taxones (p. ej., Bacteroidia, Gammaproteobacteria y Verrucomicrobiota) (ref. 51 y referencias allí), muchos de los cuales son capaces de mucho un crecimiento más rápido y tendrían una ventaja competitiva como especialistas cuando los polisacáridos estén disponibles. Sin embargo, en el océano oscuro, donde los polisacáridos se agotan, las expansiones de genes parálogos pueden proporcionar al grupo I una ventaja competitiva al permitirles utilizar una amplia gama de azúcares, ácidos de azúcar y compuestos relacionados, lo que lleva al aumento observado en la abundancia relativa. La piezotolerancia de las células SAR202 también les daría una ventaja competitiva en el océano oscuro61. Sin embargo, observamos que existen otros grupos de SAR202 (por ejemplo, el grupo III) que se sabe que contribuyen sustancialmente a la alta abundancia relativa del clado SAR202 en las regiones oceánicas más profundas. El aislamiento y la caracterización de una diversidad más amplia de SAR202, especialmente linajes típicos del océano oscuro, podrían impulsar futuras investigaciones que tengan como objetivo reconstruir la química y la ecología del carbono en el océano oscuro.

Se ha propuesto diversificaciones evolutivas de enzimas parálogas en células SAR202 para beneficiar a estas células al ampliar la gama de compuestos orgánicos que pueden metabolizar8,12. Para explicar las vías no fosforilativas para la oxidación del azúcar que informamos, y la posibilidad de un conjunto mucho mayor de vías paralelas en las mismas células, planteamos la hipótesis de que las células SAR202 del grupo I han evolucionado para explotar compuestos de carbohidratos relativamente raros que no son cosechados por los taxones. especializándose en los tipos de carbohidratos más comunes. Los carbohidratos son estructuralmente complejos debido a la quiralidad de los monómeros, la diversidad de enlaces que forman y modificaciones como la O-metilación y la sulfatación. En este escenario, SAR202 explota un nicho, cosechando una clase de compuestos que son recalcitrantes debido a su baja abundancia y diversidad estructural. Esta combinación de características, es decir, alta complejidad molecular y bajas concentraciones de especies moleculares individuales, está asociada con la hipótesis de la diversidad molecular62, una explicación principal para el secuestro de carbono oceánico en moléculas disueltas con tiempos de rotación milenarios. Nuestros hallazgos no son contrarios a esta hipótesis; en cambio, sugieren una clase de compuestos que se acumularían por las mismas razones si un tipo de célula en particular, como el grupo I de SAR202, no hubiera desarrollado un mecanismo único para recolectarlos. Cabe señalar que los depósitos de carbono en el océano oscuro también podrían verse afectados por otros grupos SAR202. Por ejemplo, se ha sugerido que el grupo III de SAR202, que se sabe que es más abundante que el grupo I en el océano oscuro, contribuye a la degradación y transformación de la materia orgánica recalcitrante utilizando un repertorio ampliado de monooxigenasas flavinadependientes8,12.

En resumen, describimos el cultivo logrado del abundante y ubicuo clado bacteriano marino SAR202, un superorden monofilético dentro de la clase Dehalococcoidia del filo Chloroflexota. Las cepas SAR202 crecieron muy lentamente y su crecimiento se vio inhibido aún más por la exposición a la luz; Estas propiedades podrían explicar por qué no se han cultivado anteriormente. Mostramos que estas células contienen expansiones parálogas y que estos parálogos pueden organizarse en vías no fosforilativas para el catabolismo de los azúcares y sus formas lactona y ácida. Mostramos que la fucosa y la ramnosa, sustratos previstos de estas vías, mejoraron el crecimiento del aislado SAR202.

Exploramos la fisiología de un superorden de bacterias que han estado implicadas en la oxidación de una variedad de formas de carbono orgánico semilábil, y parece probable que estudios adicionales de las diversas células de este clado contribuyan a una comprensión más mecanicista de El ciclo del carbono oceánico. Los cultivos celulares de nuevos procariotas brindan oportunidades para estudiar una amplia gama de propiedades celulares que no pueden determinarse únicamente a partir de los genomas. Las interacciones de estas células de crecimiento lento con exometabolitos de carbono orgánico y su inexplicable sensibilidad a la luz son vías prometedoras para trabajos futuros. Los estudios de la función de la archaella de SAR202 y su integración con la envoltura celular de SAR202 pueden proporcionar pistas sobre la ecología y la arquitectura celular de estas células inusuales. Los hallazgos que informamos proporcionaron información sorprendente sobre los desafíos que plantearon el estancamiento del cultivo de SAR202 durante mucho tiempo. Queda por ver si la diversidad de linajes aún no cultivados de células SAR202 que habitan en el océano oscuro puede explicarse por propiedades similares.

Se recolectaron muestras de agua de mar utilizadas para cultivos de alto rendimiento (HTC) basados ​​en dilución hasta extinción y análisis de amplicones a una profundidad de 10 m en dos estaciones (GR1 y GR3) en el Mar Occidental de Corea (Mar Amarillo) en octubre de 2017. (Figura complementaria 1a). Las propiedades fisicoquímicas de las muestras de agua se presentan en la figura complementaria 1b. El número total de procariotas se determinó contando las células teñidas con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) utilizando un microscopio de epifluorescencia (Nikon 80i, Nikon) después de la filtración utilizando un filtro de membrana de policarbonato de tamaño de poro de 0,2 μm (Millipore). . El medio de cultivo para HTC (LNHM) se preparó utilizando una muestra de agua de mar recolectada del Mar del Este (profundidad, 10 m) en 2016. En resumen, la muestra de agua de mar se filtró usando un filtro de membrana de polietersulfona de tamaño de poro de 0,2 μm (Pall). esterilizado en autoclave (1,5 h), rociado con CO2 (8 h), aireado (24 h) y modificado con fuentes de carbono, macronutrientes (fuentes de nitrógeno y fósforo), oligoelementos, vitaminas y aminoácidos (Tabla complementaria 1). Luego, las muestras de agua de mar se diluyeron con medios de cultivo hasta una concentración de 5 células ml-1 y se dispensaron (1 ml por pocillo) en microplacas de 48 pocillos (BD Falcon). Las placas se incubaron a 20 °C durante 1 mes en la oscuridad o bajo luz LED (Philips; temperatura de color correlacionada, 3000 K; intensidad de la luz, ~155 μmol fotones m–2 s–1) con un ciclo de luz/oscuridad de 14: 10 h. El crecimiento microbiano en cada pocillo se examinó mediante citometría de flujo (citómetro de flujo GUAVA EasyCyte Plus y Guava CytoSoft (v5.3), Millipore) después de teñir con SYBR Green I (Life Technologies) y se registró como crecimiento positivo cuando más de 5,0 × 104 Se detectaron células mL-1. Los cultivos de pocillos de crecimiento positivo se utilizaron para análisis adicionales y se almacenaron como solución madre de glicerol (10%, v/v) a -80 °C.

Los análisis filogenéticos de cultivos de crecimiento positivo se basaron en la amplificación por PCR y la secuenciación de genes de ARNr 16S. Se prepararon plantillas de ADN para PCR a partir de cultivos de crecimiento positivo utilizando InstaGeneTM Matrix (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La amplificación de los genes 16S rRNA se realizó mediante PCR utilizando cebadores 27F y 1492R, seguido de secuenciación Sanger con cebadores 800R y 518F (Macrogen Inc., Corea). La clasificación taxonómica de 610 cepas obtenidas de los experimentos de HTC se llevó a cabo utilizando el comando “classify.seqs” del paquete de software Mothur (v1.39.5)63 utilizando la base de datos SILVA SSURef NR99 (versión 132)64 como referencia. Para un análisis taxonómico y filogenético más refinado de los aislados SAR202, las secuencias del gen 16S rRNA se alinearon utilizando el alineador en línea SINA (v1.2.11, http://www.arb-silva.de/aligner)65, importado al programa ARB66. e insertado utilizando la parsimonia ARB en el árbol guía de la base de datos SILVA SSURef NR99 (versión 132)64. Después de la curación manual, las secuencias alineadas de los aislados y sus parientes filogenéticos se exportaron con el filtro “ssuref:bacteria”. Se construyeron árboles filogenéticos de máxima verosimilitud utilizando RAxML67 (v8.2.12) con el método GTRGAMMA que incluye 100 réplicas de arranque y se visualizaron utilizando el software MEGA (v7.0)68.

Se filtraron dos litros de cada muestra de agua de mar (GR1 y GR3) a través de un filtro de membrana de polietersulfona con un tamaño de poro de 0,2 μm (Supor, Pall). El ADN se extrajo directamente de los filtros de membrana utilizando el kit DNeasy PowerWater (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Las regiones V4-V5 de los genes 16S rRNA se amplificaron utilizando cebadores de fusión diseñados en base a cebadores universales, 518F y 926R69. Los productos de PCR agrupados se secuenciaron en la plataforma Illumina MiSeq (300 pb, extremo emparejado; Chunlab Inc.). Los análisis de las secuencias del amplicón del gen 16S rRNA se realizaron utilizando QIIME270 después del recorte del cebador con cutadapt (v2.7)71.

Las cepas SAR202 se cultivaron y mantuvieron usando LNHM5x a 20 °C en oscuridad. Los experimentos de crecimiento se realizaron utilizando LNHM, LNHM5x y ASW5x. Las recetas detalladas de los medios se presentan en la Tabla complementaria 1. El crecimiento bacteriano se controló mediante citometría de flujo y la pureza y la identidad de los cultivos se determinaron periódicamente mediante la secuenciación de los genes de ARNr 16S amplificados y mediante examen microscópico.

El crecimiento de la cepa JH545 se controló a temperaturas que oscilaron entre 4 y 37 °C en la oscuridad. Se realizaron pruebas de sustrato de crecimiento utilizando ʟ-ramnosa, ʟ-ramnono-1,4-lactona, ʟ-ramnonato, ʟ-fucosa, ʟ-fucono-1,4-lactona, ʟ-fuconato y ascorbato. Todos los compuestos probados se adquirieron de Sigma-Aldrich. Estos productos químicos se agregaron al medio ASW5x a una concentración final de 250 μM. Los cultivos se incubaron en oscuridad a 20 °C.

Para el examen inicial del efecto de la exposición a la luz sobre el crecimiento de SAR202 (Fig. 2b), se inocularon células en LNHM a una densidad celular inicial de ~1,0 × 104 células ml-1 y se incubaron en una cámara equipada con LED (3000 K; Phillips), con un ciclo de luz/oscuridad de 14:10 h. La intensidad de la luz fue de ~155 μmol de fotones m-2 s-1. Para probar el efecto de la intensidad de la luz en el crecimiento de SAR202 (Fig. 2c), se utilizó un equipo hecho a medida con una matriz de LED (3000 K) y un atenuador de luz, y las intensidades de la luz se establecieron en ~45 (luz débil). , ~89 (luz media) y ~134 (luz fuerte) μmol fotones m−2 s−1. Durante la prueba, las luces permanecieron encendidas continuamente. Todos los experimentos incluyeron muestras de control que se mantuvieron constantemente en la oscuridad envolviendo los tubos o matraces con papel de aluminio. La intensidad de la luz se midió utilizando un fotómetro digital (TES-1335; TES).

La morfología celular se observó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM; CM200, Philips) y microscopía electrónica de barrido (SEM; S-4300 y S-4300SE, Hitachi). Para preparar muestras para TEM, se filtraron 20 ml de cultivo con un prefijo de glutaraldehído al 2,5% usando una membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 0,2 μm sobre la cual se colocaron rejillas de cobre recubiertas de formvar/carbono, seguido de tinción de las rejillas con acetato de uranilo (2 %). Para TEM de sección delgada, las células centrifugadas de 800 ml de cultivo se sometieron a fijación primaria con solución de Karnovsky (paraformaldehído al 2%, glutaraldehído al 2,5%), fijación posterior con OsO4 al 2%, tinción en bloque con acetato de uranilo al 0,5%, secuencial. deshidratación con etanol al 30, 50, 70, 80, 90 y 100% e inclusión con resina (EMBed-812, Electron Microscopic Science). Finalmente se realizó el corte con un cuchillo de diamante. Se tiñeron secciones delgadas con acetato de uranilo (2%). Para el análisis SEM, se concentraron 100 ml de cultivo mediante centrifugación, se fijaron con glutaraldehído al 2,5%, se fijaron posteriormente con OsO4 al 1%, se deshidrataron con etanol al 30, 50, 70, 80, 90 y 100% y se secaron químicamente con hexametildisilazano ( Sigma-Aldrich). Las muestras tratadas se montaron suavemente sobre un cubreobjetos y se recubrieron con una fina capa de carbón.

El ADN genómico de las cepas SAR202 se extrajo de sedimentos celulares obtenidos mediante centrifugación de cultivos líquidos (~1 L), utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. El ADN genómico de las cepas JH545 y JH1073 se utilizó para la construcción de la biblioteca SMRTbell de 20 kb, la cual fue secuenciada en la plataforma PacBio RS II (Pacific Biosciences). El ensamblaje de novo de lecturas de secuenciación sin procesar se llevó a cabo mediante el protocolo RS_HGAP_Assembly.2 de SMRT Analysis (v2.3.0), lo que resultó en un único contig. El contig se circularizó usando Circlator (v1.5.5)72 y se pulió usando el protocolo RS_Resequencing.1 de Análisis SMRT para obtener la secuencia final del genoma con corrección de errores. La secuenciación del genoma de las cepas JH702 y JH639 se realizó en la plataforma Illumina HiSeq (2 × 150 pb). Las lecturas sin procesar se recortaron usando BBDuk con las siguientes opciones: ktrim=rk=23 mink=11 hdist=1 tpe tbo ftm=5 qtrim=rl trimq=10 minlen=100. El ensamblaje de los datos de secuenciación de Illumina se realizó utilizando SPAdes v3.11.1 en modo de múltiples celdas con error de lectura y corrección de discrepancias73.

Las secuencias del genoma se enviaron al sistema IMG-ER para su anotación. Prokka (v1.12)74 también se utilizó para la anotación. Las secuencias de proteínas predichas se analizaron utilizando BlastKOALA75 y KofamKOALA76 para la reconstrucción de la vía metabólica basada en KEGG Orthologs (KO). También se realizaron anotaciones mediante eggnog-mapper (v2.0.1) 77 y hmmsearch (v3.3) en bases de datos de proteínas como Pfam para una anotación funcional más precisa y detallada. El análisis de CAZymes se realizó utilizando dbCAN278. Se creó un mapa de vías metabólicas utilizando BioRender (https://biorender.com). Los valores de ANIb entre genomas se calcularon utilizando JSpeciesWS79. Las islas genómicas se predijeron utilizando IslandViewer 480. La comparación del genoma se visualizó mediante BLAST Ring Image Generator (BRIG)81.

Las secuencias del genoma SAR202 del presente estudio y de un estudio previo12 se clasificaron utilizando GTDB-Tk (v1.7.0), lo que indicó que los genomas pertenecían a ~10 órdenes diferentes según la GTDB. Se utilizaron genomas representativos de estos órdenes para construir un árbol filogenómico del clado SAR202. Utilizamos UBCG pipeline82 para obtener una alineación concatenada de genes centrales. Se construyó un árbol de máxima verosimilitud utilizando RAxML (v8.2.12)67, con una opción PROTGAMMAAUTO que incluye 100 iteraciones de arranque.

Las regiones genómicas alrededor de los genes HeR del genoma JH545 se visualizaron utilizando Easyfig83. La alineación de múltiples aminoácidos de HeR de JH545 y el primer HeR caracterizado (48C12) se realizó utilizando ClustalW84. Se aplicó el esquema de color Clustal X de Jalview (v2.11.1.3)85 para visualizar la alineación.

Se recolectaron varias secuencias de FlaB para análisis filogenético. Además de las búsquedas en la literatura, se buscaron ortólogos putativos de FlaB JH545 utilizando SHOOT86 (https://www.shoot.bio/), lo que resultó en la recuperación solo de FlaB arqueales. Se buscaron FlaB bacterianos utilizando BlastP en IMG-ER y NCBI (base de datos n.º) con FlaB JH545 como consultas. Además, se buscó en AnnoTree utilizando K07325 (flagelina arqueal FlaB) como consulta. Las secuencias recopiladas se alinearon usando MUSCLE, seguido de la construcción de árboles usando RAxML (v8.2.12) con la opción PROTGAMMAAUTO. Los FlaB de MAG o SAG afiliados a filos bacterianos distintos de Chloroflexota se eliminaron de los análisis, ya que estos FlaB fueron los únicos encontrados en sus respectivos filos, lo que sugiere la posibilidad de contaminación. También se eliminaron algunos FlaB de arqueas que son mucho más largos que otras secuencias. Algunos genomas en los que se encontró FlaB se utilizaron para visualizar el mapa genético del grupo de genes archaella utilizando Easyfig.

Se asignó un total de 80 proteínas a COG4948 mediante la anotación IMG-ER del genoma JH545, que también fue verificada mediante la búsqueda de dominio conservado87 (v3.18) en NCBI. Una búsqueda en la base de datos Pfam-A (por Pfam_Scan.pl; ambas disponibles en https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/Pfam/) mostró que 74 proteínas COG4948 tenían dominios PF02746 y PF13378. Las seis proteínas restantes tenían dominios PF13378 (cuatro proteínas) o PF02746 (dos proteínas). Los dos dominios Pfam se encontraron sólo en 80 proteínas COG4948. Con base en estos resultados que muestran una correspondencia entre COG4948 y los dos dominios Pfam, decidimos utilizar los dos dominios Pfam para el cálculo aproximado de la proporción de proteínas COG4948 en genomas representativos de grupos de 47,894 especies de GTDB (R202). Los archivos genómicos faa (gtdb_proteins_aa_reps_r202.tar.gz) se descargaron del repositorio GTDB (https://data.gtdb.ecogenomic.org/) y se buscaron utilizando hmmsearch (v3.3) en los archivos hmm de los dos dominios Pfam. con la opción “cut_tc”. La proporción aproximada de proteínas COG4948 en cada genoma se calculó dividiendo el número de resultados de hmmsearch por el doble del número de CDS. Los resultados se visualizaron utilizando el paquete R 'tidyverse'.

Las 80 secuencias de proteínas COG4948 de JH545 se enviaron a la herramienta de similitud de enzimas (EFI-EST; https://efi.igb.illinois.edu/efi-est/)42 para generar un SSN. Un total de 77,142 proteínas en la base de datos UniProt (v2020_02) que tenían los dos dominios Pfam se incluyeron en el SSN, que se construyó utilizando BLAST con opciones predeterminadas. El SSN obtenido se exploró utilizando Cytoscape (v3.7.2)88. Después de la aplicación de un umbral de corte de puntuación de alineación (mayor o igual a 150), se retuvieron para su visualización los grupos que incluían las 80 proteínas COG4948 de la cepa JH545.

La reconstrucción de las vías de degradación de fucosa y ramnosa no fosforilativas se basa en un mapa de vías KEGG (metabolismo de fructosa y manosa; mapa00051), vías MetaCyc (degradación de l-fucosa II/III y degradación de l-ramnosa II/III) y varias publicaciones46, 47,52,53,54,55. Cuando fue necesario, las proteínas caracterizadas en informes anteriores se exploraron en la base de datos UniProt o se analizaron mediante búsqueda en CD en el NCBI para determinar sus asignaciones COG.

La abundancia relativa de la población JH545 en metagenomas marinos se estimó utilizando CoverM (v0.6.1; https://github.com/wwood/CoverM). Los metagenomas de varias trincheras marinas, la estación ALOHA (recopiladas en diciembre de 2011) y algunas estaciones de Tara Oceans se descargaron de SRA y se recortó su calidad utilizando BBduk (v38.86)89. Los genes de ARN ribosómico y ARNt del genoma JH545 se enmascararon antes de los análisis. CoverM se ejecutó con las siguientes opciones: --mapper bwa-mem --methods related_abundance --min-read-aligned-length 50 --min-read-percent-identity 95. Tenga en cuenta que solo se utilizó el genoma JH545 como referencia genoma. El valor umbral para "--min-read-percent-identity" se estableció en 95%, un valor de ANI ampliamente utilizado para la demarcación de especies, ya que queríamos estimar la abundancia relativa de lecturas de metagenomas que podrían considerarse del mismo especie como JH545. La lista de muestras de metagenomas se proporciona en Datos complementarios 2.

El análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos celulares (FAME) se realizó utilizando el protocolo estándar proporcionado por el sistema de identificación microbiana MIDI/Hewlett-Packard. Para extraer FAME, se recolectaron células de la cepa JH545 mediante centrifugación a 13.000 × g durante 1 h al final de la fase de crecimiento exponencial en un volumen de 400 ml de cultivo líquido (medio ASW5x). Los FAME extraídos se saponificaron y metilaron antes de ser analizados utilizando un cromatógrafo de gases (Agilent 7890 GC) con base de datos TSBA6 del Sherlock Microbial Identification System (MIDI) versión 6.1.

Lucifugimonas (Lu.ci.fu.gi.mo’nas. L. fem. n. lux, lucis, light; L. fem. n. fuga, flight; L. fem. n. monas, a unit, monad; N.L. fem. n. Lucifugimonas, a monad that prefers dark habitats).

Aeróbicos, oligotróficos y quimioheterotróficos. Gram negativos con envoltura monodermo. Las células son inmóviles y dimórficas con bastones cortos de ~0,8 × 0,4 µm y cocos de ~0,5 µm de diámetro. No forme colonias en placas de agar sólido. Crece muy lentamente y alcanza la fase estacionaria a los 50 días de crecimiento en un medio de agua de mar artificial. La luz inhibe el crecimiento celular. Los principales ácidos grasos celulares se suman con la característica 9 (C17:1 ω9c y/o 10-metilo C16:0), 10-metilo C18:0 y C16:0 (Tabla complementaria 4). El género "Candidatus Lucifugimonas" está asignado al grupo Ia de SAR202 dentro de la clase Dehalococcoidia según la filogenia del gen 16S rRNA y la filogenómica del genoma completo. La especie tipo del género es “Candidatus Lucifugimonas marina”.

Lucifugimonas marina (ma.ri'na. L. fem. adj. marina, marina, del mar).

Además de las propiedades dadas en la descripción del género, la especie se describe a continuación. El crecimiento se produce a temperaturas entre 10 y 25 °C, pero no a 4 °C o menos, ni a 30 °C o más. La temperatura óptima de crecimiento es de 15 a 20 °C. Crece sólo en medio líquido a base de agua de mar o en medio de agua de mar artificial. El crecimiento celular se ve favorecido por la fucosa, el fuconato, la fucono-1,4-lactona, la ramnosa, la ramnono-1,4-lactona, el ramnonato y el ascorbato. La cepa tipo, JH545, se aisló de agua de mar epipelágica frente a la costa de la bahía de Garorim en Tea-An, Corea del Sur. La longitud de la secuencia completa del genoma de la cepa tipo es de 3,08 Mbp con un 51,8% del contenido de ADN G + C. El número de acceso de GenBank de la cepa tipo es CP046146. Además de la cepa tipo, las secuencias completas del genoma de las cepas JH639, JH702 y JH1073 que pertenecen a esta especie también están disponibles con los números de acceso de GenBank WMBD00000000, WMBE00000000 y CP046147, respectivamente.

Candidato Lucifugimonadaceae (Lu.ci.fu.gi.mo.na.da.ce'ae. NL fem. n. Lucifugimonas, un género bacteriano; -aceae, que termina en denotar una familia; NL fem. pl. n. Lucifugimonadaceae, la familia Lucifugimonas).

La descripción es la misma que la del género “Candidatus Lucifugimonas”. El género tipo es “Candidatus Lucifugimonas”. Equivalente a GTDB f__UBA1328 (R207).

Candidato Lucifugimonadales (Lu.ci.fu.gi.mo.na.da'les. NL fem. n. Lucifugimonas, un género bacteriano; -ales, que termina para denotar una familia; NL fem. pl. n. Lucifugimonadales, las Lucifugimonas orden).

La descripción es la misma que la del género “Candidatus Lucifugimonas”. El género tipo es “Candidatus Lucifugimonas”. Equivalente a GTDB o__UBA1151 (R207).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos relevantes que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y en sus archivos de información y datos complementarios. Las secuencias del gen 16S rRNA de 24 aislados del grupo I de SAR202 generados en este estudio se han depositado en la base de datos GenBank con los números de acceso OQ689977 a OQ690000. Las secuencias completas del genoma generadas en este estudio están disponibles en la base de datos GenBank con los números de acceso CP046146 (JH545), CP046147 (JH1073), WMBD00000000 (JH639) y WMBE00000000 (JH702). Los datos genómicos también están disponibles en la base de datos IMG/M con los ID del genoma 2901382945 (JH545), 2917498938 (JH1073), 2892960865 (JH639) y 2892963810 (JH702). Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Esta investigación fue apoyada por el Programa de Biorrecursos de Alta Mar del Instituto Coreano de Promoción de Tecnología y Ciencias Marinas (KIMST), financiado por el Ministerio de Océanos y Pesca (KIMST-20210646 a J.-CC) y subvenciones de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) ( NRF-2022R1A2C3008502, NRF-2018R1A5A1025077 y NRF-2021M3A9I4021431 a J.-CC; NRF-2022R1A6A3A01087360 a YL) financiado por el Ministerio de Ciencias y Tecnología de la Información y las Comunicaciones de Corea.

Departamento de Ciencias Biológicas y Bioingeniería, Universidad Inha, Incheon, 22212, República de Corea

Yeonjung Lim, Ji-Hui Seo y Jang-Cheon Cho

Centro de Biología Molecular y Celular, Universidad Inha, Incheon, 22212, República de Corea

Yeonjung Lim y Ilnam Kang

Departamento de Microbiología, Universidad Estatal de Oregón, Corvallis, OR, 97331, EE. UU.

Stephen J.Giovannoni

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J.-HS y J.-CC planificaron y diseñaron el proyecto de aislamiento inicial. YL y J.-HS realizaron los experimentos. YL, J.-HS e IK analizaron los datos. YL, IK, SJG y J.-CC escribieron y revisaron el manuscrito. IK y J.-CC supervisaron el proyecto.

Correspondencia con Ilnam Kang o Jang-Cheon Cho.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Brett Baker y Yusuke Okazaki por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Lim, Y, Seo, JH, Giovannoni, SJ et al. Cultivo de bacterias marinas del clado SAR202. Nat Comuna 14, 5098 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40726-8

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Recibido: 04 de abril de 2023

Aceptado: 07 de agosto de 2023

Publicado: 22 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40726-8

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